IVT（InVitroTranscription） 是 mRNA 生产工艺中至关重要的步骤。一个高效的 IVT 体系能够显著提高产量、减少物料消耗并降低生产成本。同时，它也能保证 mRNA 分子的完整性、加帽率以及防止 dsRNA 杂质的掺入，从而提升核心质量指标，降低后续纯化过程的难度，扮演着连接整个工艺环节的关键角色。IVT 反应的整体流程相对简单，标准 IVT 体系主要由以下成分组成：DNA 模板、T7 RNA 聚合酶（T7 RNAP）、NTPs、无机焦磷酸酶、RNase 抑制剂及反应缓冲液等。

在这个体系中，DNA 模板通常为 PCR 产物或线性化质粒，内含 T7 启动子、5' UTR、CDS、3' UTR 和 Poly(A) 等元素。NTP 作为 mRNA 转录的底物可以通过更换为修饰核苷酸来实现针对 mRNA 的特定修饰，从而提升其稳定性和免疫原性。无机焦磷酸酶和 RNase 抑制剂则作为辅助成分，前者能够水解转录过程中产生的焦磷酸，提高反应效率，后者则用于抑制可能存在的 RNase 污染。

在 IVT 反应体系中，T7 RNAP 是核心酶，负责识别 DNA 模板并进行 RNA 的合成。与其他 RNA 聚合酶相比，T7 RNAP 具有高度特异性的优点，不依赖于其他蛋白或辅助因子便可完成转录。因此，T7 RNAP 成为体外转录生成 mRNA 的优选酶。其结构类似于握拳，包含一个 N 端和一个 C 端结构域，C 端结构域进一步细分为拇指、手掌及手指亚结构域，DNA 模板则结合在这些亚结构域间的间隙中。

研究表明，温度对 IVT 反应中常规 mRNA 与 saRNA 的产量和质量有重要影响。随着温度从 20℃ 升高至 42℃，saRNA 的产量会增加，但其完整性在超过 32℃ 时却会迅速下降。为优化 saRNA 的完整性，研究者们开始筛选低温转录的 T7 RNA 聚合酶作为新的研究方向。部分研究也表明，在高温条件下，转录可显著减少因 3' 端过度延伸而导致的 dsRNA 产生，同时提高转录产物的免疫原性。

在加强 T7 RNAP 热稳定性的研究中，通过酶定向进化平台和荧光激活液滴分选技术（FADS），研究者筛选出多种 T7 RNAP 突变体，包括耐热型及高比活型等。这些突变体在固定的反应条件下表现出色，显著提高了转录产量和反应完整性。相较于野生型酶，耐高温突变体 M16 在 52℃ 下的半衰期增加了 270 倍，催化活性也提升了 58 倍。

在关于 IVT 体系的缓冲液优化方面，高性能的酶固然重要，但合适的反应缓冲液也至关紧要。IVT 缓冲液通常包含多种成分，如盐类、pH 缓冲剂等，成分的浓度和比例对 RNA 聚合酶的活性、特异性和稳定性有直接影响。研究发现，在 pH 值和镁离子的选择中，适宜的范围能够有效提高 mRNA 的合成效率。

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